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肖丹1，何百川1，刘擘2 1.医院 2.北京大学医学部 摘要 目的对人退变半月板石蜡切片的制作方法进行规范与改进。方法从固定到染色对人退变半月板石蜡切片的各个步骤进行了细化，并分组比较不同脱钙液脱钙以及不同脱水情况下的切片效果。结果采用10%甲酸溶液进行脱钙，按照“70%乙醇0.5h、80%乙醇2.5h、95%乙醇1h、95%乙醇1h、%乙醇1.5h、%乙醇1.5h”步骤进行脱水的组织切片效果最好。结论人退变半月板石蜡切片制作时选用合适的脱钙和脱水方法，各步骤严格规范操作，可取得较好的切片效果。 关键词：退变半月板；石蜡切片；组织学；脱钙 半月板是位于股骨与胫骨间的半月形纤维软骨组织[1]，其在增强膝关节稳定性，吸收和传递负荷，润滑关节等方面发挥巨大作用[2]。近年来，为了进一步了解半月板退变原因，制定退变标准，探索退变半月板剩余利用价值，有大量关于退变半月板的组织学研究[3-7]。但半月板组织结构属于纤维软骨型，其致密胶原纤维沿半月板长轴平行排列[8]，这种组织学特点使半月板具有一定硬度。与羊、兔等动物相比，人半月板胶原结构更为致密，当半月板发生退变时，其组织钙化程度较重[5，9]，所以制作人退变半月板的石蜡切片存在相当大的难度。既往专门关于半月板切片方法的研究很少[10-11]，而且没有针对人退变半月板的相关研究。本文以骨性关节炎患者的退变半月板为材料，从固定到染色对石蜡切片的各个步骤进行细化，并分组比较不同脱钙液脱钙以及不同脱水情况下的切片效果，从而对人退变半月板的石蜡切片制作方法进行了改进。 1资料与方法 1.1临床资料人退变半月板取自北医三院运动医学研究所膝关节置换术中摘除的完整外侧半月板，共56例（男25例，女31例；27个左侧，29个右侧；年龄58～82岁），编号为1～56。 1.2方法 1.2.1固定每块半月板从人体取出后2h内，如图1所示，在其体部截取3块厚度为3mm的组织，随机编号为A、B、C，置入10%中性甲醛溶液固定，溶液量/组织体积＞10，固定48h。 1.2.2脱钙随后将编号为A的组织置入10%甲酸溶液，B置于20%甲酸溶液，C置于蒸馏水中，脱钙3天。 1.2.3冲洗脱钙完成后，将每块组织分别装入组织包埋盒内，流水过夜，洗去组织内的酸性溶液。 1.2.4脱水将编号为1～28半月板的组织块按Ⅰ步骤进行脱水，将编号为29～56半月板的组织块按Ⅱ步骤进行脱水，见表1。 1.2.5透明将脱水完成的组织放入二甲苯（Ⅰ）（Ⅱ）各0.5h，完成透明过程。 1.2.6浸蜡与包埋用石蜡Ⅰ（熔点60℃）浸蜡1h，石蜡Ⅱ（熔点60℃）浸蜡2h，随后使用同种石蜡进行包埋。 1.2.7石蜡切片待组织块冷却至室温之后，将其按5μm厚度进行切片，每次切片前均要用表面平整的冰块冷敷蜡块表面，后用吸水纸吸干蜡块表面水分，刀片每切约5张切片应换用新刀片。将切下来石蜡带放入42℃温水中展平，用阳离子载玻片捞片后置于60℃烤片机上烤片30min，随后放入60℃温箱中2h，调整温箱温度至40℃继续放置12h。 1.2.8染色按常规染色方法进行HE染色、封片。 1.2.9观察普通光学显微镜下观察各组切片，发现不同切片存在的主要问题有：①存在较多皱褶；②组织酸化，核仁崩解、结构紊乱；③组织破碎，见图2。记录不同处理条件下存在问题的切片数量。 2结果 其中采用20%甲酸溶液脱钙的B组组织酸化最严重，采用蒸馏水进行对照，不脱钙的C组组织皱褶、破碎问题最严重；采用Ⅰ步骤脱水的组织存在的问题明显少于采用Ⅱ步骤脱水的组织，见表2。所以采用10%甲酸溶液脱钙，Ⅰ步骤脱水，其他步骤按上文提出的标准方法进行，制作的半月板石蜡切片效果最好。 3讨论 半月板属于纤维软骨组织，在已有文献中，其组织学处理通常为固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色，但人半月板组织较硬，且退变后会发生程度不一的钙化[5，9]，所以如果不对其进行脱钙处理，在切片时会存在组织过硬的问题，导致出现大量皱褶、组织破碎。合适的酸性脱钙液，不仅可以去除组织中的钙质，还有一定的组织软化作用。由于既往没有类似关于半月板脱钙方法的研究，而半月板与骨、软骨组织相比，其含钙量相对较少，所以本研究采用了骨组织常用脱钙液中酸性较弱的10%和20%甲酸溶液[12-14]对半月板进行脱钙处理。因为半月板主要成分为胶原纤维，所以难以通过“针刺无阻力”来作为脱钙完成的标志。本研究前期预实验发现，分别用10%、20%甲酸溶液脱钙3d与脱钙7d相比，半月板硬度差别不大，但脱钙7d的半月板组织酸化严重，所以脱钙时间统一采用了3d。本研究发现，与未脱钙组比较，10%甲酸溶液脱钙3d，能够取得较好的脱钙效果，组织中的皱褶和碎裂现象减少；而20%甲酸溶液则因酸性过强，易将组织酸化，破坏半月板正常组织结构。 半月板在固定时，选用10%的中性福尔马林溶液能够完整的保存半月板细胞的正常形态结构，防止其抗原弥散。将半月板纵向切为厚度为3mm的组织块，溶液量/组织体积＞10，固定24～48h即可取得较好的固定效果，若固定时间过长，会使组织变硬，造成切片困难[15]。固定完成后，将组织置入10%甲酸溶液脱钙3d，之后为了不影响后续染色，需要将半月板组织流水冲洗8h以上，以彻底洗去组织中含有的酸性溶液。 对于人体组织的脱水过程，骨组织因硬度较大，在酒精中的脱水时间明显短于人体其他组织，本研究参照骨组织和其他脏器组织的脱水过程，制定了Ⅰ、Ⅱ两种脱水步骤。实验结果表明，采用Ⅰ步骤进行脱水的半月板组织切片效果更好，因为Ⅰ步骤缩短了在70%～95%乙醇的脱水时间，防止进一步的收缩硬化，而且并未发现Ⅰ步骤处理的组织存在脱水不充分的问题。此外，有研究表明，在组织进入二甲苯透明之前，可将其放入20%乙醇+80%二甲苯混合液中进行处理，以达到更好的脱水效果[16-17]，这种处理效果可在后续实验中进一步验证。此外，冬季进行脱水应在37℃恒温箱进行，以消除温度对脱水的影响[17]。 因二甲苯透明过久易导致组织变硬变脆，切片时容易发生破碎[18]，透明时间过短则组织内乙醇不能被完全置换，石蜡无法渗透到组织中[19]，所以透明时间应进行严格控制。本研究在组织脱水完成后将其放入二甲苯（Ⅰ）（Ⅱ）各30min[20]，既能很好的完成透明过程，又防止了组织进一步变硬。 因退变半月板组织硬度较大，所以在其浸蜡和包埋步骤中，应选用高硬度蜡，且浸蜡及包埋温度不宜过高，否则会导致组织硬度增加[21]，切片时容易出现皱褶[18]，本研究选用的是熔点60℃的切片专用石蜡，在半月板石蜡切片中效果较好。此外，有研究表明，将蜂蜡与石蜡进行1:9混合，能够进一步增加石蜡硬度和韧性，利于切片平展无褶皱[22]。 切片这一步骤是整个过程成败的关键，按照规范要求完成固定、脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋之后，应选用经验丰富的实验技术人员进行切片操作，每个石蜡块应切取5张以上，选取其中最好的一张进行进一步处理。切片时，不宜将石蜡块冷藏处理后再进行切片，因为这会进一步增加半月板硬度，提高切片难度。应在石蜡块处于室温（20℃）时进行切片，在每次切片前，均应使用表面平整的冰块冷敷蜡块切面，注意冰块接触面应大于蜡块，使蜡块各处均匀冷却，之后用吸水纸吸尽蜡块表面的水滴。在切片时，用力要均匀一致，不要用力过重，切片机应放置平稳，减少震动[23]。因半月板组织硬度及韧性较好，切片刀每切5～6张切片之后应更换刀片，防止刀口变钝造成组织皱褶和碎裂。切片完成后，将蜡带平铺在42℃温水平面展片，随后选用阳离子防脱载玻片进行捞片，防止半月板组织脱落。之后将载玻片放在烤片机上60℃烤30min，放入温箱60℃烘烤2h，调整温度至40℃放置12h后即可进行染色，以上烘烤步骤可将切片展平，减少切片过程中产生的皱褶。 综上所述，人退变半月板石蜡切片的制作难度很大，从固定到切片每一步都需要严格把控，尽量减少增加组织硬度的步骤。本研究细化了人退变半月板的石蜡切片制作过程，并通过分组比较，找到了合适的脱钙及脱水方法。在今后退变半月板石蜡切片制作过程中，掌握好上述方法，并根据半月板退变情况及实验条件进行适度调整，会极大提高切片质量。 参考文献略 版 权 声 明 本文为《当代医学》杂志原创文章。其他媒体、网站、
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