在骨折愈合过程中，骨骼和免疫系统通过常见的细胞前体和分子介导物紧密地相互作用。初步的炎症反应包括巨噬细胞向骨折区迁移，对骨修复的远期疗效有重要影响。有趣的是，巨噬细胞存在于骨折愈合的所有阶段。因此，我们假设巨噬细胞在随后的骨再生阶段中起着关键作用。

该研究在一个标准闭合性股骨骨折的小鼠模型中，研究了在体内使用氯膦酸脂质体诱导巨噬细胞减少对骨修复不同愈合阶段的影响。巨噬细胞的减少对早期骨折愈合没有明显的影响，但导致了迟发性硬愈伤组织的形成，从而严重改变软骨内成骨。氯丙酸处理的动物清楚地显示延迟骨巩固软骨和增强骨膜骨形成。因此，我们决定放弃探究非治疗小鼠骨折愈合过程中的巨噬细胞分布，着重于M1和m2亚群的鉴定。我们观察到m2macrophages明显在骨化阶段流行。因此，我们研究了巨噬细胞中增强m2表型，以进一步促进骨愈合。在3周的调查期间，通过白细胞介素4和13诱导M2巨噬细胞显著增强骨形成。这些累积的数据说明了迄今为止尚未报道的它们在软骨内的重要作用：在M1/M2的巨噬细胞功能中，骨化和精细平衡的必要性似乎是强制性的骨折愈合和成功再生。

结果：

1.巨噬细胞耗竭实验

为了验证巨噬细胞在清除碎片过程中除了吞噬功能外还有一个作用的假设，在骨折愈合的细胞中，我们决定在手术之前将它们消耗掉:在本研究中所描述的clodrateliposome治疗(图S1A)(MAC动物=巨噬细胞耗损小鼠)达到了65%的巨噬细胞减少。由于适度的先天性免疫反应，这个还原水平仍然允许存在残余的巨噬细胞。这是目前为止其他研究中所描述的巨噬细胞的减少，其降低率约为80%。尽管先天免疫系统对于复杂的愈合过程中的重要作用，这个处理对骨再生过程的影响仍然很严重。由于氯膦酸钠治疗(箭头示破骨细胞染色)，骨折骨痂数目没有明显改变(Fig.S1B)。

2.巨噬细胞耗竭导致愈合延迟

据我们的观察。而愈伤组织的三维重建显示，由于MAC组持续的非矿化裂缝巨噬细胞数量的大幅减少导致内部不一致。骨折愈合在WT第21天，间隙在第28天仍然可见

在MAC组(图1A)。定量μCT分析表明,愈伤组织总量(CV)，MAC组在第14天和第21天显著降低(图1B)。另外，MAC组的骨体积(BV)显著降低。第21天(图1C)。这些数据表明软骨内成骨反应减少且可能延迟。MAC中低CV组的表明非矿化组织(软骨和纤维结缔组织)和连续的低BV(由于紊乱的软骨内骨化)在MAC组被发现。MAC组的BV/CV值越高(图1D)，其愈伤组织体积显著降低，而肌内骨形成增强，但这并不能成功地弥合骨折间隙。MAC愈伤组织的骨密度(BMD)与wt愈伤组织(图1E)相同。愈合骨的生物力学能力在第21天达到对侧完整侧的值。相比之下，MAC小鼠在第21天和第28天的最大扭转力矩和扭转刚度显著降低(图2A和B)。合并后，联合被推迟，愈伤组织矿化被推迟MAC组受损;虽然mac的耗竭已经过去了远没有其他人报告的那么强，这说明了一般情况巨噬细胞在早期愈合级联中的相关性。

3.软骨内骨化引起的软骨吸收延迟

我们决定通过组织学证实μCT数据(图3)。因此,从第7天开始，MAC小鼠在愈合过程中表现出明显的延迟，软骨(对照组从第14天开始矿化)一直持续到第28天。奇怪的是，在离骨折间隙较远的外愈伤组织的膜内骨化在衰竭的动物中增强(图3A中的箭头表示)。通过组织形态测量（TCT指数，图3B）对软骨分布的量化表明，在第7天，MAC老鼠的软骨比正常情况下的软骨更少。然而，尽管WT小鼠的软骨在第21天时完全被吸收，但MAC小鼠的软骨仍可大体测量。另一方面，总骨组织(TOT指数，图3C)在愈合过程中各组间无显著差异，说明骨形成过程本身不受巨噬细胞缺乏的干扰。软骨内骨化通过透明软骨(II型胶原)向肥厚的软骨(X型胶原)进入成矿组织。进一步的调查胶原蛋白II和胶原蛋白X的分布显示，在正常愈合过程中，胶原蛋白II和X都存在于早期的愈合阶段，在愈合后的21天内，它们在愈伤组织中并不明显(图4，箭头所指)。另一方面，在巨噬细胞耗尽的动物中，两种胶原不仅在早期愈合时间被发现持续存在，在第21天仍可检测到(图4，由图4所示箭头)。这是一个明显的迹象，成熟的软愈伤组织是在没有大量巨噬细胞存在的小鼠中发生改变。

4.巨噬细胞对膜内骨化的影响

愈合后14天形成的愈伤组织的差异表现在了在对照组中可见致密骨形成(图5A)尤其是靠近骨折的外周愈伤组织骨形成的间隙，通过膜内骨化。巨噬细胞衰竭的早期影响可能是改变血液运行，巨噬细胞是细胞外基质重塑的重要组成部分。因此，在骨折14天后，在血管的愈伤组织评估血管的数量。与野生型相比，在MAC动物中，Alpha平滑肌阳性率较低(p=0.)。然而，差异并不显著。因此，减少巨噬细胞的数量对血管的形成没有明显的影响。此外，编织骨小梁之间的骨内空间含有红细胞，因此是再生过程的供应通路的一部分(见图5B)。确定编织骨小梁之间的骨内区域尽管平均小梁尺寸较小(图5C)，在theMAC组中显示了类似数量的空间，这导致骨内间隙的总面积显著降低(p=0.)，因此MAC组的无骨面积百分比显著降低(p=0.)。

5.巨噬细胞和骨化相关基因的基因表达变化

为了进一步研究巨噬细胞在分子水平上的骨折愈合作用，我们分析了巨噬细胞和骨化的差异表达基因。通过“guiltbyassociation”分析，与巨噬细胞相关的基因与骨化相关(图6A)。在给定的时间点，WT和MAC动物之间这些基因表达的变化与相应的愈合阶段一致(图6B/C)。基于μ-array的结果分析,四个巨噬细胞相关基因差异表达在单个或多个时间点通过疗愈过程:亚兰:趋化因子(C-Cmotif)配体4,也称为巨噬细胞炎性蛋白1β;Mapk14:丝裂原活化蛋白激酶14;Il1β:白介素-1β,Snca:α-突触核蛋白。在早期的愈合过程中，Ccl4、Mapk14和il12.5倍的表达，在这些动物的愈合过程中，Snca的表达要明显地低到14天。因此，巨噬细胞相关基因在早期愈合期表现出最明显的变化(图6B)。此外，4个与骨化相关的基因在单个或多个时间点上均有差异表达(图6C):Bglap1:骨伽玛谷氨酸蛋白，也称为骨钙素;Ibsp:整合素结合唾液蛋白;Mmp13:基质金属蛋白酶13;Ubb:泛素B.与骨化过程相关的基因在早期阶段发生改变，Ubb表现出增加的表达，在后期阶段，Mmp13和Bglap1在编织骨形成和矿化过程中，巨噬细胞衰竭动物的表达水平显著降低。从7天开始，Ibsp的表达水平从最初的高表达水平显著降低。这种低表达在整个骨形成阶段，甚至在重塑阶段都被检测到。

6.巨噬细胞在骨愈合过程中表型改变

根据观察到的巨噬细胞耗尽的动物的惊人结果，我们决定进一步分析这些细胞在正常愈合过程中的活性，重点

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